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原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項
發布時間:2023-08-29   點擊次數:79次

 原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項

上海信帆提供原位雜交實驗檢測服務。原位雜交實驗通常流程由組織切片+探針+DAB染色+掃片或者拍照構成,那么詳細的操作步驟和對樣本的處理要求具體是什么呢,讓我們一起來探索一下吧!

實驗流程:

  1、組織固定:組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

  2、脫水:組織固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟,包埋。

  3、切片:石蠟經切片機切片,攤片機撈片,62°烤箱烤片2h。

  4、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

  5、消化:根據組織固定時間長短,切片于修復液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻。后基因筆畫圈,根據不同組織不同指標特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

  6、阻斷內源性過氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

  7、預雜交:滴加預雜交液,37°C孵育1h。

  8、雜交:傾去預雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過夜。

  9、雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。

  10、滴加封閉液:滴加封閉血清 BSA。室溫30min。

  11、滴加鼠抗高辛標記過氧化物酶(anti-DIG-HRP):傾去封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min,后PBS洗4次×5min。

  12、DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。

  13、復染細胞核:Harris蘇木素復染3min左右,自來水洗,1%鹽酸酒精分化數秒,自來水洗,氨水返藍,流水沖洗。

  14、脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,中性樹膠封片。

  15、顯微鏡檢,圖像采集分析。


  結果判讀:

  陽性為棕黃色,細胞核為藍色。


送樣要求:

1、切片前處理要求:新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片;或取2mm左右厚度的新鮮組織,5min內投入原位雜交固定液內固定,4℃低溫保存運輸,切勿冷凍結冰,盡快包埋切片后進行原位雜交實驗,固定時間過長影響核酸檢出率;

2、冰凍切片:冰凍切片-20℃運輸;

3、石蠟切片:石蠟切片常溫運輸;

4、細胞爬片:細胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,換無酶PBS,密封,4℃運輸。

 

 原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項

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